Skaningowy mikroskop sił atomowych

Skaningowy mikroskop sił atomowych (AFM) i jego zastosowanie w medycynie

W ostatnim dziesięcioleciu, mikroskopia sił atomowych (AFM – ang. Atomic Force Microscopy) stała się coraz powszechniejszą metodą badawczą wykorzystywaną w naukach przyrodniczych i medycznych. Działanie mikroskopów tego typu polega na pomiarze oddziaływań występujących pomiędzy badaną próbką a sondą, posiadającą kształt ostro zakończonej igły. Pomiar sił działających pomiędzy próbkującą sondą AFM a badaną powierzchnią jest dokonywany z dokładnością rzędu pikoNewtonów. Dokładna kontrola stosowanej siły oraz rozmiary próbkującego ostrza (rzędu kilku, kilkudziesięciu nanometrów) umożliwiają precyzyjny i prawdziwie lokalny pomiar własności mechanicznych, takich jak sztywność, mikrotarcie czy adhezja.

 

Konstrukcja mikroskopu jest bardzo podobna do konstrukcji gramofonu, gdzie umieszczona na końcu długiego ramienia igła odtwarza dźwięk podczas ruchu okrężnego w rowkach płyty muzycznej. W mikroskopie sił atomowych rolę ramienia pełni elastyczna sprężynka, na końcu której znajduje się delikatne ostrze przesuwane po powierzchni badanej próbki (lub w bardzo bliskiej odległości nad nią). Pod wpływem siły działającej pomiędzy atomami ostrza i atomami próbki sprężynka ulega wychyleniu, które jest bardzo precyzyjnie mierzone. W najczęściej stosowanym optycznym układzie pomiarowym promień lasera jest ogniskowany na końcu sprężynki a fotoczuły detektor rejestruje położenie promienia odbitego. Nawet bardzo mała zmiana wychylenia sprężynki powoduje przesunięcie położenia promienia odbitego, a wielkość i kierunek tego przesunięcia informują o siłach działających na sprężynkę, umożliwiając pomiar sił z dokładnością nawet do kilkunastu pikoNewtonów.

Zdolność rozdzielcza mikroskopu AFM jest porównywalna ze zdolnością rozdzielczą mikroskopów elektronowych i umożliwia odwzorowanie szczegółów powierzchni o wielkości porównywalnej z rozmiarami atomu. Pomiar może zostać przeprowadzony zarówno w próżni jak w powietrzu, a także – co jest szczególnie atrakcyjne dla pomiarów biofizycznych – w cieczy. Pomiar w cieczy redukuje występujące w powietrzu siły kapilarne. Efektem tego jest lepsza kontrola przyłożonej siły i ochrona delikatnej próbki biologicznej przed zniszczeniem. Otworzyło to nowe możliwości w dziedzinie badań biologicznych, gdyż stało się możliwe badanie żywych próbek biologicznych w ich naturalnym środowisku, z rozdzielczością pozwalającą na badanie bardzo małych struktur biologicznych, takich jak białka czy też łańcuchy DNA.

Najprostszym zastosowaniem AFM jest pomiar topografii powierzchni próbki, przy czym warto zaznaczyć, że jest to rzeczywisty i trójwymiarowy obraz, podczas gdy w mikroskopii elektronowej uzyskany obraz jest dwuwymiarową projekcją. Poniżej zamieszczono przykładowe obrazy powierzchni komórek (Rys. 1. a i b) oraz organizacji filamentów aktynowych zmierzonych na powierzchni żywego fibroblastu (Rys. 1 c i d). Rysunek 1e przedstawia zdjęcie mikroskopu sił atomowych pracującego w IFJ PAN w Krakowie.

                        

Rysunek 1. (a,b) Obrazy topografii powierzchni żywych komórek: (a) keratynocyty i (b)komórki epithelium (b) zmierzone dla rozmiaru skanu 80 μm x 80 μm. (c, d) Organizacja filamentów aktynowych fibroblastu zmierzona dla większego powiększenia tj. 10 μm x 10 μm. (e) Zdjęcie mikroskopu sił atomowych pracującego w Instytucie Fizyki Jądrowej PAN w Krakowie (model XE120, Park Systems).

Topografia dostarcza informacji o wielkości i kształcie struktur występujących na powierzchni badanej próbki. Dzięki temu można było zaobserwować np. jak wygląda powierzchnia makrofagów pożerających kuleczki lateksowe lub jak zachowuje się fibrynogen w procesie krzepnięcia krwi. Wnikanie wirusów do komórek, enzymatyczna degradacja DNA, obserwacja żywych, ludzkich płytek krwi podczas ich aktywacji, to tylko niektóre dalsze zastosowania tego typu mikroskopu.

Jednak AFM bada nie tylko topografię powierzchni, ale również umożliwia pomiar takich własności próbki jak adhezja czy elastyczność. Przykładem takiego zastosowania są badania własności elastycznych żywych komórek prowadzone w Instytucie Fizyki Jądrowej PAN w Krakowie. Na podstawie relacji pomiędzy przyłożona siłą a powstałym ugięciem materiału jest wyznaczana wartość modułu Young’a. Zmiany wielkości modułu Younga zmierzone dla żywych komórek niosą informację o przemianach zachodzących w strukturze cytoszkieletu komórki. Dzięki możliwości pomiaru własności elastycznych żywych komórek mikroskopia sił atomowych stała się nową, obiecującą techniką do wykrywania zmian patologicznych w komórkach nowotworowych, poprzez pomiar deformowalności pojedynczych komórek. W ostatnich latach dowiedziono, że komórki nowotworowe (pochodzące między innymi z linii komórkowych raka piersi, prostaty, pęcherza moczowego, jelita, melanomy) są bardziej deformowalne, co ilościowo ujawnia się poprzez mniejszą wartość modułu Young’a. Obserwowana zmiana jest zależna od rodzaju komórek i stanu progresji nowotworowej (Rysunek 2).

Rysunek 2. Porównanie wartości modułu Young’a dla linii komórkowych pochodzących z różnego typu nowotworów.

Biorąc pod uwagę opublikowane do tej pory wyniki badań prowadzonych na liniach komórowych wydaje się, iż mikroskopia sił atomowych może być pomocna patologom do oceny zmian nowotworowych, także w materiale tkanowym. Pilotażowe pomiary własności elastycznych dokonywanych za pomocą AFM dla próbek pobranych z raka trzonu macicy (adenocarcinoma o pośrednim stopniu zróżnicowania) pokazały większą deformowalnóść (mniejszy moduł Young’a) tkanki nowotworowej w porównaniu z własnościami elastycznymi prawidłowego endometrium pobranego od tej samej osoby (Rysunek 3). Takie wyniki są zgodne z wiedzą na temat biologicznych podstaw transformacji nowotworowej.

Rysunek 3. Rozkład wartości modułu Young’a dla tkanki rakowej (czerwony kolor) oraz prawidłowego endometrium (niebieski kolor).

Przedstawione wyniki elastyczności komórek mierzonych w kontekście tkanki powodują powstawanie kolejnych pytań, takich jak "Czy możliwe jest wykrycie pojedynczej komórki lub grupy kilku-kilkudziesięciu komórek nowotworowych ? Jeśli tak, to czy możliwa jest diagnostyka nowotworów na podstawie danych z kilku komórek ?". Odpowiedź twierdząca miałaby ogromne znaczenie dla detekcji i diagnostyki nowotworów.

Kontakt: Małgorzata Lekka